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Über C60 Kohlenstoff

Entdeckung

der 60 Kohlenstoff

Carbon 60, auch C60 oder Fulleren 60 genannt, wurde 1985 an der Rice University erstmals von den Wissenschaftlern Harold Kroto, James R. Heath, Sean O’Brien, Robert Curl und Richard Smalley erzeugt.

1996 gewannen die Wissenschaftler Harol Kroto, Robert Curl und Richard Smalley den Nobelpreis für Chemie für ihre Rolle bei der Entdeckung von Buckminsterfullerenen und verwandten Fullerenen.

Das Aktivkohlemolekül Buckminsterfullerene C60 hat eine andere Form von Kohlenstoff, die der Struktur eines Fußballs mit 60 Atomen ähnelt, daher der Name Carbon 60 oder kurz C60.

C60 wurde offiziell Buckminsterfullerene in Erinnerung an den berühmten Architekten, Autor und Designer Buckminster Fuller genannt.

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Was ist es?

Der Ausdruck Fullerene bezeichnet Moleküle, die vollständig aus Kohlenstoff bestehen, wie Graphit oder Diamant, und die unterschiedliche geometrische Formen annehmen können. Das Fulleren C60, eine Kugel, die kleiner als der Nanometer ist, ähnelt der Form einer geodätischen Kuppel. Fulleren C60 ist daher ein reines Molekül aus 60 Kohlenstoffatomen.

Fullerene kommen in der Natur, aber auch im Weltraum vor. Sie können natürlich und in geringen Dosen während der Verbrennung, in Blitzen durch die Atmosphäre oder künstlich, wie beim Verdampfen von Graphit unter einer neutralen Gasatmosphäre, vorkommen.

Gegenwärtig wurden mehr als 1300 Studien zu Fullerenen veröffentlicht, darunter eine wichtige Studie an Ratten, die große Hoffnungen weckt und über die immer noch gesprochen wird.

Das neue Super-Antioxidans

Dieses phänomenale Ergebnis basierte auf der Entdeckung, dass Carbon 60 Olivenöl eine beispiellose Quelle von Antioxidantien ist. Die antioxidative Aktivität von C60 ist 172-mal höher als die von Vitamin C und daher das beste jemals entdeckte Antioxidans.

Seine außergewöhnliche Fähigkeit, oxidativen Stress zu bekämpfen, ist nur der Beginn seiner spektakulären Wirkung, dank seines Rückgangs, seiner bemerkenswerten und vollständigen Resorption im Magen-Darm-Trakt sowie seines vollständigen Verschwindens in den zehn Stunden nach seiner Resorption. Fulleren C60 wird hauptsächlich über die Gallenwege und nicht über die Harnwege ausgeschieden.

Studien haben bereits gezeigt, dass die Verabreichung bei Mäusen nicht nur die Lebensdauer, sondern auch den altersbedingten kognitiven Mangel verlängert.

Studien im Jahr 2011 haben auch gezeigt, dass sie sich positiv auf das Wachstum und die Lebensdauer von primitiven Organismen wie Grünalgen oder verschiedenen Arten von Aspergillus-Pilzen auswirken.

FORSCHUNG

Baati T, et al. Die Verlängerung der Lebensdauer von Ratten durch wiederholte orale Verabreichung von [60] Fulleren.

Umfassende Forschung zu C60-Kohlenstoffölen
1. Einleitung – C60 Carbon Oil

Seit 1993 haben unzählige Studien gezeigt, dass [60] Fulleren (C60) und Derivate in mehreren Bereichen der Biologie und Medizin [1] überaus wichtige Potenziale aufweisen, vor allem in Bezug auf spezifische DNA-Spaltung, Bildgebung [2], UV- und Strahlenschutz [3], antivirale und antioxidative Eigenschaften und Anti-Amyloid-Aktivitäten [1,4–7], allergische Reaktion [8] und Angiogenese [9], immunstimulierende und Antitumorwirkungen [10,11], verstärkende Wirkung auf das Wachstum von Neurit [12], Gen. Entbindung [13] und sogar Haarwuchsaktivität [14]. Obwohl mehrere unabhängige Arbeitsgruppen die Unbedenklichkeit von unberührtem C60 bestätigten [15–17], ist die Toxizität dieses Fullerens immer noch umstritten [18, 19]. Wie kürzlich gezeigt wurde, liegt dies hauptsächlich an der mangelnden Charakterisierung der getesteten Materialien [15–19]. Das metabolische Schicksal und die in vivo chronischen Wirkungen von C60 selbst sind jedoch weiterhin unbekannt. Um das Potenzial von C60 und Derivaten im biomedizinischen Bereich auszuschöpfen, müssen diese Probleme angegangen werden.

Zuvor wurden wässrige Suspensionen verwendet, um die akuten und subakuten Toxizitäten sowie die in vivo antioxidativen Eigenschaften von unberührtem C60 zu untersuchen [20, 21]. Solche Suspensionen eignen sich jedoch nicht zur Bestimmung der Toxizität bei wiederholten Dosen, da Fulleren nur in löslicher Form aktiv ist [21] und weil sich C60 extrem langsam auflöst
in biologischen Medien verhindert die genaue Kontrolle der aktiven Fraktion [21]. Dies ist möglicherweise der Grund, warum die chronische Toxizität von C60 nach unserem Kenntnisstand noch nie untersucht wurde.

C60 ist sowohl in Lipidtröpfchen in lebenden Zellen [21] als auch in Fetten im Allgemeinen löslich [22, 23]. Darüber hinaus kann C60 frei Membranbarrieren überqueren, wie experimentell beobachtet [21] und kürzlich durch Computersimulationen modelliert [24]. Daher sollten die C60-Wechselwirkungen mit lebenden Systemen sowie ihre Toxizität unter Verwendung löslicher Formen bestimmt werden.

Vor kurzem wurden Liposomen als Träger verwendet, um die Bio-Verteilung von nicht-modifizierten C60 bei Ratten nach Schwanzvene Verabreichung zu untersuchen [25]. Aber, wie C60 nicht in Blut nachgewiesen wurde aufgrund seiner schnellen Clearance durch Gewebefiltration, war eine solche Formulierung nicht geeignet für seine Pharmakokinetik Charakterisieren [25].

Während C60 Löslichkeit in pflanzlichen Ölen [22, 23] nicht hoch genug ist, zu studieren, seine akute Toxizität nach institutionellen Empfehlungen (European Medicines Agency, Bewertung von Humanarzneimitteln, 2004) [26], sollen solche Lösungen sein durchaus angemessen für das Studium seine chronische Toxizität bei wiederholten Dosen [27].

Da das in-vivo-Verhalten von löslichen Formen von C60, einschließlich Absorption, Bio-Verteilung und Eliminierung unbekannt waren, stellten wir fest, die in-vivo-Schicksal von C60 in Olivenöl gelöst, bevor seine chronischen Auswirkungen auf wiederholte Dosen zu studieren.

Ölige Lösungen können aufgrund der möglichen Gefäßobstruktion intravenös verabreicht werden, so dass wir die Pharmakokinetik von C60 gelöst in Olivenöl gekennzeichnet (0,8 mg / ml) nach der Schlundsonde (og) und intraperitoneale (IP) Verabreichung an Ratten (4 mg / kg Körpergewicht (mg / kg kG)).

Schließlich wird, wie C60 bekannt ist, ein starkes Antioxidans sein [5, 6, 21], überprüften wir die Auswirkungen von C60-Olivenöl-Lösungen auf oxidativen Stress in einem klassischen Modell der CCl4-Intoxikation bei Ratten [28, 29]. Obwohl der oxidativen Stress beteiligt in CCl
4 Intoxikation unwahrscheinlich ist, während der pathophysiologischen Bedingungen auftreten, CCl4 Intoxikation in Ratten stellt ein wichtiges Modell für die Aufklärung des Mechanismus der Wirkung von hepatotoxischen Effekten wie Verfettung (Steatose), Fibrose, hepatozellulärem Tod und oxidativer Stress Karzinogenität beteiligt ist [28, 29 ].

2. Materialien und Methoden

2.1. C60-Olivenöl-Lösung Vorbereitung:

Natives Olivenöl wird aus einer Chemlali Boughrara Sorte aus Tunesien in der Sahelzone gepflanzt erhalten. C60 wurde ohne weitere Reinigung aus den USA erhalten und verwendet. 50 mg C60 wurden in 10 ml Olivenöl gelöst, indem sie in der Dunkelheit für 2 Wochen bei Umgebungstemperatur gerührt wird. Die resultierende Mischung wurde bei 5.000 g für 1 h zentrifugiert, und der Überstand wurde mit 0,25 & mgr; m Porosität durch einen Millipore-Filter filtriert.

2.2.Pharmacokinetics und Biodistributionsuntersuchungen

Alle experimentellen Verfahren wurden von der Tierversuche Ethikkommission von Paris XI Universität überprüft und genehmigt.

2.2.1. Pharmakokinetik

Pharmakokinetische Untersuchungen wurden mit männlichen Wistar-Ratten (Gewicht 200-220 g) durchgeführt. Die Ratten wurden in Einzelkäfigen gehalten und in einem klimatisierten Raum (22-25 ºC) auf einen 12 h Hell / Dunkel-Zyklus mit Wasser und Nahrung zur Verfügung untergebracht. Die Ratten wurden für 7 Tage vor der Behandlung akklimatisieren.

Nach Natriumpentobarbital (20 mg / kg Körpergewicht in 1,0 ml / kg KG) Anästhesie wurde ein Katheter in die rechte Jugularvene der Ratte eingeführt, positioniert subkutan mit der Spitze in der Zwischen scapular Region. Die vorbereiteten Ratten wurden dann für 24 Stunden erholen gelassen und das Blut Katheter wurde mit 0,9% NaCl-Lösung, die 20 IU gespült / ml Heparin mögliches Gerinnsel Hindernis zu vermeiden.

Vor C60 Verabreichung wurden die Ratten über Nacht fasten gelassen, aber mit Zugang zu Wasser. Die gleiche Einzeldosis von C60 (4 mg / kg Körpergewicht) oral zugeführt, durch eine Sondennadel oder intraperitoneal zu zwei Gruppen von je drei Ratten. Blut (0,20 ml) wurde über den canular vor der Dosierung (t = 0) und bei 15, 30, 60 min abgezogen und dann nach 2, 4, 8, 10, 12, 24 und 48 h nach der Dosierung. Antithrombin Heparin (20 IU / ml) wurde in jeder Blutprobe zugesetzt. Nach jeder Blutentnahme wurden 0,20 ml steriler 0,9% iger NaCl-Lösung für das Tier injiziert, um zu verhindern Hypovolämie. Die Ratten wurden 48 Stunden nach der C60 geopfert
dministration für organ Collection (Leber, Milz und Gehirn). Urine wurden bei 24 h und 48 h nach Verabreichung C60 dann gefroren bei -20º Cuntil Analyse gesammelt.

2.2.2. Biodistribution

Für Bioverteilungsstudien, 4 Gruppen von 3 Ratten (mit einem Gewicht von 200 ± 20 g) täglich für 7 Tage behandelt wurden entweder durch ip-Verabreichung (2 Gruppen) oder eine Schlundsonde (2 Gruppen) mit der gleichen Dosis (4 mg / kg bw) der gleiche C60-Öl-Lösung (0,8 mg / ml). Am Tag 1 (D 1) und D8, eine Gruppe von oral behandelt und eine Gruppe von IP-behandelten Tiere wurden für Blut- und Organsammlung geopfert. Urine wurden täglich gesammelt und dann unter den gleichen Bedingungen eingefroren, wie für pharmakokinetische Studien.

2.3. Chronische Toxizität und Auswirkungen von C60 auf das Überleben von Ratten

Die Ratten wurden drei pro Käfig untergebracht und für 14 Tage akklimatisieren, vor der Dosierung. Drei Gruppen von 6 Ratten (10 Monate alt, mit einem Gewicht von 465 ± 31 g) wurden täglich für eine Woche verabreicht, dann wöchentlich bis zum Ende des zweiten Monats und dann alle zwei Wochen bis zum Ende des 7. Monats, von gavages mit 1 ml von Wasser oder Olivenöl oder C60 in Olivenöl gelöst (0,8 mg / ml), respectively.

Die Ratten wurden vor jeder Dosierung gewogen. Routinebeobachtungen nach der offiziellen Empfehlungen [27] wurden innerhalb und außerhalb des Käfigs einmal täglich während der gesamten Studie auf Anzeichen einer Abweichung von der normalen Aktivität, Morbidität und Mortalität bei allen Tieren.

2.4 Auswirkungen von C60-Olivenöl-Lösungen auf oxidativen Stress

Sechzig Ratten zufällig eingeteilt in 10 Gruppen von 6 Ratten wurden täglich durch oralen gavages für 7 Tage vorbehandelt (og Gruppen) oder durch intraperitoneale Injektion (ip Gruppen). Gruppen A (GAog und GAIP) erhielten 1 ml Wasser. Die Gruppen B und C (GBog, GCOG und GBIP, GCIP) wurden mit 1 ml Olivenöl vorbehandelt während Gruppen D und E (GDog, GEOG und GDip, GEIP) wurden mit 1 ml von C60-Olivenöl vorbehandelt.

Vierundzwanzig Stunden vor der Tötung, Gruppen GA, GC und GE wurden ip mit einer Einzeldosis von CCl4 (1 ml / kg Körpergewicht), während GB und GD, injiziert als Kontrollen verwendet, mit einer 0,9% igen wässrigen NaCl-Lösung unter den gleichen verabreicht wurden Bedingungen.

2.5. Chromatographische Analysen, Probenvorbereitung und Verfahrensvalidierung
2.5.1. chromatographische Analysen

Chromatographische Analysen von C60 im Blut, Urin, Leber, Milz und Gehirn wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [30] mit den folgenden Modifikationen.

HPLC-Trennungen wurden mit einem P4000 Multilösungsmittelabgabesystem mit einem UV6000LP Photodiodenarray-Detektor (Thermo Separation Products, Les Ulis, Frankreich), die mit durchgeführt. Instrument Überwachung und Datenerfassung wurden unter Verwendung von ChromQuest Software aus dem gleichen Ursprung durchgeführt. Spitzen Identifikationen wurden aufgrund ihrer UV – Sichtbare Spektren und die Spuren wurden bei 330 nm aufgezeichnet. Separationen wurden mit einer Hypersil 120-5 ODS durchgeführt, um 5
Kartusche (Macherey-Nagel, Hoerdt, Frankreich) geschützt mit einer 4,0 mm x 10 mm Vorsäule, gepackt mit der gleichen stationären Phase.

Für Leber- und Milz-Proben, Trennungen wurden bei 25 ºC mit einer Strömungsgeschwindigkeit eingestellt auf 0,8 ml / min und eine mobile Phase, die aus einer Mischung aus Toluol und Methanol (35/65, v / v) durchgeführt wird.

Für Vollblut, Urin und Gehirn-Proben, Trennungen wurden mit 20% Toluol und 80% Methanol für die erste 5 min durchgeführt, wobei zu dieser Zeit das Toluol für 10 min auf 60% erhöht wurde und dann konstant halten, für die restlichen 7 min eines jeden Probenlauf. Mindestens 10 Säulenvolumina der Ausgangszusammensetzung wurde durch die Säule vor dem Einspritzen die Probe gespült.

2.5.2. Probenvorbereitung

Für Vollblut, hundert ml Proben wurden in 400 ul 0,1 M Natriumdodecylsulfat (SDS) verdünnt. Nach Zugabe von 0,5 ml wurde aus Acetonitril und Schütteln für 5 min, C60 extrahiert Zugabe von 5 ml Toluol, enthaltend 0,2 & mgr; g / ml von C70 als interner Standard verwendet (IST) zu dem Gemisch gegeben und für 24 h Schütteln im Dunkel. Nach Zentrifugation (2000 g für 15 min) wurde der Überstand unter einem Stickstoffstrom eingedampft. Dann wurde der Rückstand in 0,1 ml Toluol gelöst und verdünnt in Acetonitril (50/50, v / v) vor der Injektion von 100 & mgr; l in die Chromatographen.

Für Urin, 1,0 ml Probe wurden mit 0,2 ml Acetonitril vermischt und dann in eine Sep-pak sowie C18-Patrone (Waters, St. Quentin en Yvelines, Frankreich) prealably mit 5 ml eines Gemisches aus Wasser / Acetonitril konditioniert (10 / 2, v / v). den C18-Kartusche mit 5 ml Acetonitril nach dem Waschen zurückgehalten die Verbindungen mit 2 ml Toluol eluiert wurden, das 0,2 & mgr; g / ml von C70 und unter einem Stickstoffstrom verdampft. Der Rückstand wurde dann in 0,1 ml Toluol gelöst und verdünnt in Acetonitril (1/1, v / v) vor der Injektion von 100 & mgr; l in die Chromatographen gelöst.

Für Organe, etwa 1,0 g Leber (rechte Lappen), Gehirn- oder 0,2 g Milz wurden genau abgewogen und dann mit 5 ml 0,1 M SDS und 5 ml Acetonitril homogenisiert. Nach Schütteln für 5 min, 20 ml Toluol, die 2,0 ug / ml IS wurden zugegeben und das Gemisch wurde 24 Stunden im Dunkeln geschüttelt. Nach Zentrifugation (2000 g für 15 min) wurde der Überstand unter einem Stickstoffstrom eingedampft. Dann wurde der Rückstand in 1 ml Toluol für Leber und Milz Proben oder 0,2 ml Toluol für Gehirnproben gelöst und in Acetonitril verdünnt (50/50, v / v) vor der Injektion von 100 & mgr; l in die Chromatographen. Proben, die die Grenze der Linearität übersteigt wurden nach entsprechender Verdünnung erneut analysiert.

2.5.3. Methodenvalidierung

Für die Kalibrierung und die Validierung der Methode verwenden wir Vollblut, Urin und Organproben von unbehandelten Ratten, versetzt mit C60-Olivenöl-Lösungen (19/1, v / v oder m / m).

Die Linearität der Methode wurde zwischen 0,01 und 1,0 & mgr; g / ml unter Gradientenelution (y = 0,5963 x + 0,0006 geprüft; n = 6; wobei y die Peakfläche in AU min und x die Konzentration der injizierten Lösung in & mgr; g / ml; die relativen Standardabweichungen (RSD, n = 5) für die Neigung und die Abschnitte wurden 6,4% bzw. 4,3% betragen). Die Nachweisgrenze für ein Signal-Rausch-Verhältnis gleich 3 wurde 0.001μg / ml.

Unter isokratischen Bedingungen wurde die Linearität des Verfahrens überprüft, zwischen 0,01 und 10,0 & mgr; g / ml (y = 0,597 x + 0,0098, n = 7; wobei y die Fläche Peak in AU.min und x die Konzentration der injizierten Lösung in & mgr; g / ml; die RSD (n = 5) für die Neigung und die Abschnitte wurden 5,2% bzw. 3,9% betragen). Die Nachweisgrenze für ein Signal-Rausch-Verhältnis gleich 3 betrug 0,002 & mgr; g / ml. Die zwischen run (BWR) und zwischen Tag (BWD) Präzisionen wurden (n = 6) für die niedrigsten und den höchsten Pegel jeder Kurve der Kalibrierung bestimmt.

Gradientenelution unter Bedingungen waren die RSD von 7,2% und 10,5% für den BWR und 5,3% und 8,4% für die niedrigsten und die höchsten Niveaus, respectively. Unter isokratischen Bedingungen waren die RSD von 5,6% und 8,5% für den BWR und 3,3% und 6,4% für die niedrigsten und die höchsten Niveaus, respectively.

Die Rückgewinnung des Verfahrens wurde auf zwei Ebenen für jede Art von Probe bestimmt (n = 3 für jede Ebene). Für Vollblut, Urin und Gehirn-Proben wurden die Wiederfindungsraten bei 0,01 und 0,05 & mgr; g / ml bestimmt bzw. & mgr; g / g, jeweils, und sie waren 94,3 ± 4,9% und 93,8 ± 5,1% und 98,1 ± 2,5% und 96,9 ± 3,5% bzw. . Für Leberproben waren die Konzentrationen von 0,2 und 30 & mgr; g / g und die Gewinnungsraten waren 97,3 ± 2,8% und 99,1 ± 2,2% entspricht. Für Milzproben waren die Werte 2,0 und 200 ug / g und die Einziehungen und zwischen Laufgenauigkeit waren 95,3 ± 4,2% und 96,1 ± 3,2% betragen.

2.6. Biochemische Tests und pathologische Untersuchungen

Gewebe und Blutentnahme, Serum-Alanin-Amino-Transferase (ALT) -Aktivität und oxidiertem Glutathion / total Glutathion (GSSG / TGSH) -Verhältnis, wobei TGSH ist die Summe aus reduziertem (GSH) und oxidiertem Glutathion (GSSG), wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt, [30].

Superoxid-Dismutase (SOD) und Katalase (CAT) Aktivitäten wurden bestimmt, wie zuvor beschrieben [31, 32].

Hepatische Mikrosomen-Fraktionen wurden zur Messung des Cytochrom P4502E1 (CYP2E1) spezifische oxidative Aktivität wie p-nitrophenol Hydroxylase verwendet. Die hepatische mikrosomale Fraktionen wurden durch differentielle Zentrifugation hergestellt, wie zuvor beschrieben [33], und wurden bei -80 ºC aufbewahrt, bis sie benötigt. Die Hydroxylierung von p-nitrophenol 4-Nitrocatechol wurde durch HPLC bestimmt, wie zuvor beschrieben [46]. Mikrosomale Proteinkonzentration wurde durch das Bradford-Verfahren bestimmt [34], unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard.

Pathologische Untersuchungen und optische Mikroskopie-Analysen wurden blind von einem Pathologen durchgeführt, alle Protokollverfahren sowie den Zweck der Studie zu ignorieren. Die Reparatur und Färbeprotokollen der Organstücke für optische und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [21].

2.7. Die pharmakokinetische Analyse

Die pharmakokinetische Analyse der einzelnen beobachteten Daten Rattenplasma nach oralen und IP-Routen erhalten wurde mit der WinNonLin® Software (Pharsight Corporation Mountain View, Kalifornien) durchgeführt. Ein nicht-kompartimentelle Ansatz wurde verwendet, um die wichtigsten pharmakokinetischen Parameter zu berechnen.

Die maximale Plasmakonzentration (Cmax) und die Zeit (Tmax) Cmax erreicht wurden aus experimentellen Beobachtungen direkt erhalten. Die terminale Eliminationsgeschwindigkeitskonstante ( lz ) wurde durch lineare Regressionsanalyse des natürlichen Logarithmus der letzten experimentellen Konzentrationen und die terminale Halbwertszeit (t1 / 2) berechnet wurde , berechnet durch
Dividieren Ln2 durch lz . Die Fläche unter der Plasma – Konzentrations-Zeitkurve von Null bis Unendlich (AUC f0) wurde die Zugabe von AUC von Null bis zur letzten Versuchskonzentration (CT), durch die Trapezregel berechnet und der AUC von CT bis unendlich, berechnet durch Dividieren CT von AZ . Die Fläche unter der ersten Momentenkurve von Null bis Unendlich (AUMC f0 ) wurde die Zugabe von AUMC von Null bis zur letzten Versuchskonzentration (CT), durch die Trapezregel berechnet und von AUMC von CT bis unendlich, berechnet durch [(( CT.T) / aZ ) + (CT / lz 2)]. Die mittlere Verweilzeit (MRT) wurde durch Dividieren AUMC f0 durch AUC berechnet f0. Die Plasma – Clearance (Cl / F) durch Dividieren der Dosis durch AUC berechnet f0 , und die scheinbare Verteilungsvolumen (Vd / F) wurde durch Division der Dosis berechnet , indem (AUC f0 f0 .AZ).

2.8. Statistiken

Die Normalität der Datenverteilung wurde durch Shapiroe-Wilk-Test getestet. Die Daten sind als Mittelwert und Standardabweichung im Fall von Normalverteilungen oder als Median und dem Bereich präsentiert. Vergleiche mit Kontrolle wurden unter Verwendung des Student-Test durchgeführt, entsprechend der Homogenität der Varianzen von Fisher-Test bestimmt, oder durch Manne-Whitney-Test. Ein Wert von p <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Überlebensverteilungen für C60-Olivenöl-behandeln und Kontrollratten wurden durch die nicht-parametrischen Kaplane-Meier-Schätzer und verglichen mit einem Log-Rank-Test geschätzt geschätzt.

3. Ergebnisse

3.1. C60-Olivenöl Zubereitung

Die Zusammensetzung und Qualitätsmerkmale von Olivenöl bestimmt wurden, wie zuvor beschrieben folgende analytische Methoden in der EWG 2568/91 und EWG 1429/92 Vorschriften der Europäischen Union beschrieben [35].

Die sich ergebende C60-Olivenöl-Lösung ist purpurroten und enthält 0,80 ± 0,02 mg / ml (n = 6), wie durch HPLC bestimmt [30] nach entsprechender Verdünnung in der mobilen Phase. Das chromatographische Profil und die extrahierten Spektren dieser Lösungen sind ähnlich die mit einer Steuer C60-toluol äquimolaren Lösung erhalten.

Die Stabilität beider ölig und Steuerungslösungen bei Umgebungstemperatur und im Dunkeln gelagert wurde monatlich während 48 Monate überprüft. Es wurde keine Änderung unter unseren chromatographischen Bedingungen aufgezeichnet.

3.2. Pharmakokinetik und Bioverteilung
3.2.1. Pharmakokinetik

Fig. 1 stellt die Entwicklung von Vollblut C60-Konzentrationen gegen die Zeit nach Einzeldosis og und ip-Verabreichung der gleichen Dosis von C60 in Olivenöl gelöst. Tabelle 1 fasst die wichtigsten pharmakokinetischen Parameter. Die maximalen Konzentrationen (Cmax) erreicht sind 4 und 8 h nach ip und og Verabreichungen, respectively.

Die scheinbaren Verteilungsvolumen (Vd / F) von C60 nach ipadministration höher ist als das Blutvolumen bei Ratten [36], was darauf hinweisen, dass C60 gut im Gewebe verteilt wird. Der Wert von Vd / F nach og weniger bedeutsam, weil die verabreichte Dosis kann nicht durch die C60 Bioverfügbarkeit Gewichteter werden, was nicht bekannt ist (Tabelle 1).

Tabelle 1 Pharmakokinetische Paramenters [/ caption] Die Eliminationsprozess ist langsamer nach der ip-Verabreichung, als nach der og, wie sie durch die Eliminationshalbwertszeiten und die mittleren Verweilzeiten von C60 (Tabelle 1) veranschaulicht.

Fig. 1. Blutkonzentrationen nach oraler und intraperitoneale Verabreichungen. Einzelne Ratten – Vollblut C60 – Konzentrationen gegenüber Zeit – Kurve nach einer einzelnen Dosis (4 mg / kg Körpergewicht) von C60 in Olivenöl gelöst (0,8 mg / ml), verabreicht durch intraperitoneale (IP) oder orale Wege (PO: per os ) ( R1, R2, R3 = Ratte 1 Ratte 2 Ratte und 3).
3.2.2. Biodistribution

Am Tag 1 (D1) nach der Verabreichung, C60 Inhalte in Lebern und Milzen repräsentieren 0,14% und 0,18% der verabreichten Dosis auf dem oralen Weg, bzw., und 4,73% und 1,55% von der IP-Strecke, bzw. (Tabelle 2).

Nach 7 aufeinanderfolgenden Tagen nach der Verabreichung (D8), C60 Inhalte in Lebern und Milzen entsprechen 0,39% und 0,51% der gesamten verabreichten Dosis auf dem oralen Weg, bzw., und 5,54% und 2,39% von der IP-Strecke, bzw. (Tabelle 2 ).

Bei D1 und D8 C60-Gehalt im Gehirn entspricht weniger als 0,01% der Dosis nach administrierten og während dieser Werte höher sind als 0,12% nach dem ip-Verabreichung (Tabelle 2).

Die mikroskopische Untersuchung bei D8 der Milz retikuloendothelialen Systems (RES), in denen die höchsten Konzentrationen beobachtet werden, zeigt die Anwesenheit einiger C60-Aggregate, die größer und zahlreicher nach ip-Verabreichung (Abb. 2c und d) als nach og (Abb. 2a , b): C60 somit Konzentrationen erreicht die Grenze der Löslichkeit in Milzen. Im Gegensatz dazu gibt es keine beobachtbaren Ablagerungen im Inneren der Leber in allen Fällen darauf hinweist, dass C60-Konzentrationen in diesen Organen sind nicht hoch genug, um Trigger-Fällung.

Während die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bei D8 nach ip-Verabreichung zeigt zahlreiche Milz Makrophagen beladene C60-Kristalle (Abb. 2e) nur einige C60-Kristalle im Inneren der Leber Makrophagen und sehr seltene Kristalle in der Lunge (Abb. 2f) und Nierenzellen (Abb beobachtet wurden. 2g).

3.3. Chronische Toxizität und Auswirkungen von C60 auf die Lebensdauer von Ratten

Fig. 3 zeigt das Überleben der Tiere und Wachstum. Nach fünf Monaten der Behandlung (M15) eine Ratte mit Wasser behandelt nur einige tastbaren Tumoren im Bauchbereich ausgestellt. Aufgrund der rasanten Entwicklung von Tumoren (ca. 4 cm Durchmesser) diese Ratte bei M17 gestorben. Da Ratten empfindlich auf gavages zu bekannt sind, haben wir uns entschlossen, die Behandlung für alle Ratten zu stoppen und ihr Verhalten und das Gesamtüberleben zu beobachten.

Alle übrigen Tiere überlebten ohne offensichtliche Anzeichen von Verhalten Problemen bis M25 (Abb. 3a). Am Ende der M25 der Tiere der Kontrollgruppen zeigten Anzeichen von Dermatitis ulcerosa mit dem Altern während C60-behandelten Tiere normale geblieben. Da die Gewächse aller überlebenden Tiere keinen signifikanten Unterschied bis M30 (Abb. 3b) zeigte darauf hinweist, dass die Behandlung nicht ihre Nahrungsaufnahme verändern, haben wir ihr Überleben beobachtet.

Bei M38 alle mit Wasser behandelten Kontrollratten waren tot (Abb. 3a). Dies stimmt mit der erwarteten Lebensdauer dieser Tierart, die 30 bis 36 Monate. Zu diesem Zeitpunkt 67% der Olivenöl behandelten Ratten und 100% der C60-behandelten Ratten waren noch am Leben.

Die Überlebensverteilungen für C60-Olivenöl behandeln Ratten und Kontrollen wurden durch den nicht-parametrische Kaplane-Meier-Schätzer (Fig. 3) und im Vergleich mit einem Log-Rank-Test geschätzt geschätzt. Die geschätzte mittlere Lebensdauer (EML) für die C60-behandelten Ratten betrug 42 Monate, während die EMLs für Kontrollratten und Olivenöl behandelten Ratten waren 22 und 26 Monaten. Dies sind Erhöhungen von 18 und 90% für das Olivenöl und C60-behandelten Ratten, jeweils im Vergleich zu Kontrollen.

Die Log-Rank-Test führt zu X2-Werte (ein Freiheitsgrad) von 7,009, 11,302 und 10,454, wenn wir Wasser behandelten und mit Olivenöl behandelten Ratten, Wasser behandelten und mit C60-behandelten Ratten und Oliven vergleichen geölten und C60-behandelten Ratten. Dies bedeutet, dass Olivenöl die Lebensdauer der Ratten gegenüber Wasser mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,99 erstreckt, während C60-Olivenöl der Lebensdauer von C60-behandelten Ratten, die mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,999 und 0,995 in Bezug auf Wasser und Olivenöl Behandlungen erstreckt, respectively.

3.4. Wirkung von C60-Olivenöl-Lösungen auf oxidativen Stress

CCl4 Toxizität in Bezug auf Ratten ist bekannt [26, 27] doch wir systematisch die Auswirkungen dieses Halo-Alkan auf den Tieren untersuchen wir in unseren Experimenten zu vermeiden, um Fehlinterpretationen verwenden aufgrund inter-Dehnungs-Variabilität. Außerdem Fehler aufgrund von interindividuellen und inter Saison Variabilität zu vermeiden, wird eine CCl4-behandelten Kontrollgruppe wurde in jedem Experiment eingeschlossen.

3.4.1. Tierverhalten und pathologische Untersuchungen

Wenige Minuten nach CCl4-Injektion zeigten die Tiere Inaktivität, Lethargie und Piloerektion. Für beide GA-Gruppen (mit Wasser vorbehandelt nur) diese Symptome während eines Zeitraums von 24 h beibehalten, bis die Tiere für die pathologische Untersuchung geopfert wurden. Im Gegensatz dazu für die Tiere mit Olivenöl oder mit C60-Öl (GC und GD-Gruppen) diese Symptome vollständig verschwunden etwa 5 Stunden nach CCl4 Rausch vorbehandelt.

Nach Abdomens Inzision, 24 h nach der 0,9% NaCl Verabreichung, die Lebern der Kontrollgruppen GBog und GDog oral mit Olivenöl behandelt nur oder C60-Öl bzw. zeigten eine normale Morphologie mit brauner Farbe mehr für GDog Tiere ausgeprägt als für GBog Einsen ( Fig. 4).

Die Lebern von ip behandelten Kontrollgruppen GBIP und GDip auch normale Morphologie zeigen, dennoch zeigten sie große Ablagerungen von Fett aufgrund der Anhäufung des verabreichten Lipide (Abb. 4). Die braune Farbe der GDip Lebern war intensiver als die der oral behandelten Ratten (GDog).

Im Vergleich zu den Milzen von GB Tieren mit Olivenöl nur behandelt, Milzen von GD Tieren mit C60-Olivenöl behandelt zeigten eine dunklere Farbe, während die von GDip hypertrophem waren (vergrößert). Stärkere Effekte in den Erscheinungen wurden in früheren Studien nach der Verabreichung von hohen Dosen von suspendierten Kristalle C60 Nagetieren, ohne Organschädigung oder toxische Wirkung [20, 21] festgestellt.

Vierundzwanzig Stunden nach CCl4 Verabreichung, die Lebern von GA Tieren mit Wasser waren bleich vorbehandelt und sahen gesprenkelt, während ihre Nasen in den meisten Fällen adhärenten waren (5 von 6 Ratten). Im Gegensatz dazu ist die Lebern von GC und GE Gruppen vorbehandelt mit Olivenöl oder C60-Öl bzw. zeigte eine normale Morphologie mit den gleichen Funktionen wie diejenigen beobachteten für GB und GD Kontrollgruppen (Fig. 4).

Auf mikroskopischer Skala, die Leberschnitte beider GB und GD Kontrollgruppen mit Olivenöl behandelt nur oder C60-Öl ergab normale Parenchym-Architektur ohne Entzündung oder Fibrose. Diese Leberschnitten zeigten nur Hepatozyten mit klaren Zytoplasma aufgrund Lipidakkumulation (Fig. 4). Dieses Phänomen war häufiger in Leberzellen von ip behandelten Tiere als in denen von oral behandelten Tieren. In diesen Gruppen wurden C60 Ablagerungen nur in Milzen als braun und diffusen Cluster innerhalb Makrophagen mit höheren Häufigkeiten für ip behandelten Ratten festgestellt als bei oral
Behandeln (Fig. 2).

Fig. 2. Optische und elektronische microscopies. Biodistibution Studien nach 7 aufeinanderfolgenden Tagen von C60 Olivenöl Behandlung (4 mg / kg KG). Optische Mikroskopie von Milzschnitte (Hema-toxylin-Eosin – Färbung, Vergrößerung = 1000x): (a) Orale und (b) der Behandlung mit IP Olivenöl nur: (c) oral und (d) ip Behandlung mit C60 Olivenöl. Die Pfeile zeigen C60 Makrophagen mit spezifischer brauner Farbe Kristalle enthaltenden. Transmissions – Elektronen – Mikroskopie; Kidney Makrophagen im Vergleich zu (e) Milz Makrophagen zeigen TEM – Aufnahmen nur wenige C60 – Kristalle im Innern (f) die Lunge und (g).

Zur gleichen Zeit die Leberschnitte von GA und GC Tieren mitbehandelt mit Wasser und CCl4 oder mit Olivenöl und CCl4 jeweils zeigte wichtige Schäden einschließlich vieler Entzündungsbereiche sowie große nekrotische Bereiche mit Ballon nekrotischen mit einem wichtigen Steatose assoziierten Zellen (Abb. 4). Im Gegensatz dazu ergab die mikroskopische Untersuchung der Leberschnitte von GE Tiere behandelten Co mit C60-Olivenöl und CCl4, wenige Nekrosen mit einigen Ballon Zellen ohne Apoptose beschränkt auf einige Korde von Hepatozyten (Fig. 4).

3.4.2. biochemische Tests
3.4.2.1. C60 Auswirkungen auf CCI4 induzierte Leberschäden. Zirkulierender Spiegel von Alanin-Aminotransferase-Transferase-Aktivität (ALT), als biochemischer Marker für Leberschädigung verwendet [29], bestätigte Leber-Schutz durch C60.

Vierundzwanzig Stunden nach der CCl4-Injektion, die Erhöhung der ALT für GA und GC Tiere (vorbehandelt mit Wasser oder Olivenöl) kann mehr als 14-mal und 12-mal erreichen jeweils die normale Aktivität beobachtet für GB Kontrollgruppe (Fig. 5). Im Gegensatz dazu war in der Eog und Eip Gruppen vorbehandelt mit C60-Öl, der Median der ALT-Aktivität nur etwa 5 und 1,2-mal höher bzw. als die in den Kontrollgruppen beobachtet.

3.4.2.2. C60 Auswirkungen auf die endogene antioxidative Systeme: Glutathion, superoxidismutaseand Katalase-Aktivitäten.
3.4.2.2.1. Glutathionsystem.

Die Erhöhung des GSSG / TGSH Verhältnisses, als Maß für das zirkulierende Redoxgleichgewicht verwendet [21, 29], in der GA und GB-Gruppen mit Wasser und Olivenöl kann etwa 10 und 13 mal jeweils die GSSG / TGSH erreichen vorbehandelte die Kontrollgruppe (Abb. 5), wodurch die Intensität des durch oxidativen Stress reflektiert den Metabolismus von CCl 4 induzierte.

Oral Vorbehandlung mit C60-Öl verhindert deutlich die Erhöhung des GSSG / TGSH-Verhältnisses in der GDog Gruppe. Hinsichtlich der Kontrollgruppe verglichen, war die Zunahme von GSSG / TGSH im GDog Gruppe nur etwa 4-mal höher.

In der GDip Gruppe ip mit C60-Öl-vorbehandelt wurde das GSSG / TGSH sogar deutlich niedriger als in der Kontrollgruppe. Da die Leber C60-Gehalt signifikant höher nach dem ip-Verabreichung ist, als nach der og (Tabelle 2) bestätigt dieses Ergebnis die Dosis-Wirkungs-Beziehung.

Es ist erwähnenswert, dass in den GB behandelten Tiere durch C60-Öl ohne CCl4 Intoxikation der GSSG / TGSH Verhältnis wurde signifikant verringert (etwa doppelt so weniger) im Vergleich zu der Kontrollgruppe.

Fig. 3. Tier Überleben und Wachstum. Chronische Wirkungen von C 60 in Ratten. (a) Überleben und (b) das Wachstum von überlebenden Tieren,
nach der Behandlung (oral gavages) bei wiederholter Dosis (1,7 mg / kg Körpergewicht) mit Wasser, Olivenöl oder C 60 -olivenöl.

3.4.2.2.2. Superoxidismutase (SOD) und Katalase (CAT) Aktivitäten.

Tiere von GA und GC Gruppen vorbehandelt mit Wasser oder Olivenöl oral oder IP-Routen angepasst CCl4 Intoxikation durch die Katze und SOD enzymatische Aktivitäten in Erythrozyten zu erhöhen und Lebern (Fig. 6).

C60-Öl Vorbehandlung zu einer deutlichen Abschwächung der Zunahme dieser Aktivitäten führt. Zusätzlich wurde diese Dämpfung mehr in der Leber exprimiert, wo Fulleren ansammelt als in Blut (Tabelle 2).

3.4.2.3. Auswirkungen von C60 auf CCI4 Stoffwechsel.

Die mikrosomale Cyto-chrome P450 (CYP2E1) -Aktivität bestimmt nach Mikrosomen-Extraktion aus Lebern von oral behandelten Tieren zeigt, dass Ratten, die durch Erhöhung der Biosynthese von CYP2E1 zu CCl4 Intoxikation eingestellt, indem Wasser oder Olivenöl vorbehandelt (Fig. 7).

C60-Vorbehandlung deutlich abgeschwächt die Erhöhung ofCYP2E1 Aktivität nach CCl4 Rausch ohne hemmende Wirkung auf dieses Enzym.

4. Diskussion

4.1. C60-Olivenöl-Lösung Vorbereitung

Es ist bekannt, dass C60 und Derivate neigen sogar in ihren besten Lösungsmittel zu aggregieren [37]. Die C60-Olivenöl-Lösung in dieser Studie verwendet wird, kann als frei von C60-Aggregaten in Betracht gezogen werden, weil: 1 – die Farbe lila ist die C60-Lösungen, während die Farbe der C60 Aggregat haltigen Lösungen sind eher braun, charakteristisch ist, was wahr ist,
sogar für wasserlösliche Derivate [3]; 2 – es ist frei und unverzögert in Toluol löslich im Gegensatz zu C60
Aggregat haltigen Lösungen, die sich langsam selbst in den besten Lösungsmitteln C60 lösen. die Konzentrationen von C60 in Olivenöl Außerdem, wie durch HPLC bestimmt stimmen mit den zuvor von anderen Autoren veröffentlicht [22].

Die Stabilität von C60-Olivenöl-Lösung unter unseren experimentellen Bedingungen bestimmt stimmt mit den kürzlich veröffentlichten Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von [60] Fulleren signifikant die Peroxidbildung behindert somit die Stabilität der getesteten Öle zu erhöhen [38].

4.2. Pharmakokinetik und Bioverteilung
4.2.1 Pharmakokinetik

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen pharmakokinetische zum ersten Mal, dass C60 durch den Magen-Darm-Trakt (Fig. 1) absorbiert wird.

Im Fall von öligen Lösungen, die Arzneimittelfreisetzungsrate durch die Verteilungskoeffizienten des Arzneimittels zwischen dem öligen Träger und der Gewebeflüssigkeit und lipophilen Arzneimittel gesteuert wird, kann mit dem Verschwinden des öligen Trägers von der Injektionsstelle [39] freigegeben, gleichzeitig werden. Somit wird in dem Fall von IP-Verabreichung kann die Verzögerung von 4 h für Cmax erreicht (Tabelle 1) kann für die Ölphase und die Affinität von C60 zurückgeführt werden. Im Falle von stark hydrophoben Arzneimittel (Log P> 5) es ist bekannt, dass die Absorption der Moleküle durch den Magen-Darm-Trakt über die mesenterialen Lymphsystem nach Vereinigung tritt mit Lipoproteinen in den Enterozyten, anstatt über das Portal Blut zu entwickeln [ 40]. Daher wird, wenn die Octanol / Wasser-Verteilungskoeffizienten von C60 geschätzten 6,67 [41] sein, die Absorption von C60 erfolgt über die mesenterialen Lymphsystem anstatt über das Portal Blut. Die längere Verzögerung für Cmax erreicht nach der og (Tabelle 1) kann dann die Tatsache zugeordnet wird, dass die Durchflussrate der mesenterischen Lymphknoten in der Lamina propria den Enterozyten Basiswert ist etwa 500-mal niedriger als die der Pfortaderblut [40].

Cmax und die Fläche unter der Kurve (AUC) nach dem og etwa 3 Mal und 5 Mal niedriger ist jeweils als nach ip-Verabreichung. Obwohl ip-Verabreichung erlaubt nicht die absolute Bioverfügbarkeit Beurteilung schlägt AUCs Vergleich, dass ein erheblicher Prozentsatz der oral verabreichten Dosis von Magen-Darm-Trakt resorbiert wird.

Die Eliminationshalbwertszeit zeigt, dass C60 vollständig aus dem Blut 97 h nach Verabreichung, unabhängig von der Art der Verabreichung eliminiert wird. Der Unterschied in der Eliminationshalbwertszeit könnte durch eine langsame Auflösung von C60-Kristalle in der umgebenden Gewebeflüssigkeit gefolgt zu einem gewissen Ausfall von C60 in der Injektionsstelle zurückgeführt werden. Folglich stellt die AUC nach der ip-Verabreichung nur der löslichen Fraktion. Dennoch ist die ausgefällten Fraktion wahrscheinlich sehr schwach, weil die vollständige Beseitigung nur geringfügig verzögert. Die Fällung Phänomen ist unwahrscheinlich, dass für den oralen Weg vor, wenn die absorbierte Dosis beträgt etwa 5 mal kleiner und wo C60 wird durch Lipoproteine ​​getragen.

Der Eliminationsprozess folgt eine nicht-Harnweg-Route, da unmodifizierte C60 nicht in Urinproben bis 48 h nach der Verabreichung entnommen erkannt wurde. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass C60 vor allem durch die Gallengänge eliminiert wird [21], wie es vor kurzem bestätigt wurde [25]. Außerdem ist eine geringe Erhöhung der C60-Konzentrationen bei 12 und 24 h nach dem ip-Verabreichung (Abb. 1) auf das Vorhandensein eines enterohepatischen Kreislauf [40]. Darüber hinaus hat es sich gezeigt, dass bereits C60 in den Leberzellen mit Vitamin A reagiert, um eine Diels-Alder-Reaktion wie folgt sowohl in Mäusen und Ratten in [21, 42]. Diese beiden Wege können für C60 Beseitigung ausreichend sein, dennoch müssen wir suchen nach anderen möglichen Biotransformation von und Beseitigung Routen, umso mehr, als das Schicksal des Additionsprodukt ist nicht bekannt.

Fig. 4. Makroskopische und mikroskopische (Hematoxlin-Eosin – Färbung, Vergrößerung = 100x) Wirkungen von C60-Öl – Vorbehandlung (4 mg / kg Körpergewicht, während 7 aufeinanderfolgenden Tagen) auf CCI4 Intoxikation in Rattenlebern. Die Tiere wurden vorbehandelt mit (GAog – GEOG) oral gavages oder (GAIP, GEIP) ip Injektion: (GA) Wasser / CCI4: (GB) Öl / NaCI; (GC) Öl / CCI4; (GD) C60-Öl / Naic; (GE) C60-Öl / CCI4.
4.2.2. Biodistributionsuntersuchungen

Wie C60 und einige seiner Derivate akkumulieren hauptsächlich in der Leber und Milz von Nagetieren [15, 21, 42] wir die biologische Verteilung von C60 in diesen Organen untersucht. Um seine Wirkung bei wiederholten Dosen untersuchen wir untersuchten auch die Akkumulation von C60 in diesen Organen nach 7 aufeinanderfolgenden Tagen der Verabreichung.

Die Unterschiede in der C60 Inhalt in Leber und Milz (Tabelle 2) können offensichtlich auf die Unterschiede in den absorbierten Dosen zugeordnet werden. Jedoch wird die Verzögerung der Beseitigung ist etwas größer nach ip-Verabreichung könnte auch eine nicht unerhebliche Rolle spielen.

Die Anwesenheit von C60-Kristalle in den Zellen nach dem ip-Verabreichung (Abb. 2), unterstützt die Hypothese, nach der die Präzipitation eines Teils der verabreichten C60 in der Injektionsstelle auf die beobachtete Verzögerung der Beseitigung nach ip-Verabreichung beitragen. Dennoch ist die Schwäche der Organkonzentrationen insbesondere bei D8 nach 7 täglich aufeinanderfolgenden Verabreichungen von C60 gelöst in Olivenöl zeigt deutlich, dass C60-Molekül aus den Organen in ein paar Stunden nach dem beide mündlichen und ip Verabreichungen eliminiert werden.

Vorherige Ergebnisse nach ip-Verabreichung von hohen Dosen von mikronisiertem C60 erhalten [21] oder intratracheal instilliert C60
Suspensionen [43] zeigten, dass die Clearance von C60 aus Organen kann mehrere Tage dauern. Diese längeren Verzögerungen von Konsolidierungen sind wahrscheinlich aufgrund der langsamen Auflösung von C60-Kristalle im Inneren des Organs Ress [21, 43]. Im Fall der Vene Verabreichung tail [25] es ist schwierig, die Daten zu vergleichen, weil C60 mit Liposomen komplexiert wurde. Die scarceness von C60 Kristallen innerhalb Lungen- und Nierenzellen (Fig. 2) bestätigt den Unterschied im Verhalten von C60-Liposom-Komplexen, die in der Lunge nach Verabreichung Schwanzvene akkumulieren hauptsächlich [25].

Als C60 Inhalt in Lungen und Nieren wahrscheinlich schwächer als die in Leber und Milz sind, konzentrierten wir uns nur auf C60-Gehalt im Gehirn, weil die Frage seiner Translokation an das Gehirn noch eine Frage der Debatte ist [25, 43].

Wohingegen C60 Partikel wurden im Gehirn nach intratrachealer Instillation nicht detektiert [43], das Vorhandensein von signifikanten Mengen im Gehirn 24 Stunden nach dem mündlich und ip Verabreichungen unter unseren experimentellen Bedingungen (Tabelle 2) bestätigt, dass C60 solubilisiert kann das Blut-Hirn überquert Barriere [25].

Eine vollständige Biodistributionsstudie einschließlich Darm, Haut, Knochen und Fettgewebe ist im Gang in unserem Labor.

4.3. Chronische Toxizität und Auswirkungen von C60 auf das Überleben der behandelten Ratten

Als C60 nach og absorbiert haben wir ein Protokoll seiner chronischen Toxizität zu untersuchen, nach den allgemeinen Richtlinien der US-amerikanischen FDA [27] mit einigen Modifikationen. C60 hat keine akute oder subakute Toxizität bei Nagetieren [5, 15], wie es weiter wurde in verschiedenen experimentellen Modellen [16-19] bestätigt. Da es als Antioxidans wirken können (5, 6, 21), untersuchten wir ihre chronische Giftigkeit gleichzeitig mit ihren Auswirkungen auf das Überleben von Ratten.

Zehn Monate alte männlichen Ratten (M10) anstelle von jungen Ratten gewählt als offiziell empfohlen [27], um mögliche kompensatorische Effekte zu vermeiden, die während der frühen Entwicklung auftreten können [44]. Als Biodistributionsuntersuchungen nach täglich gavages zeigten, dass C60 in Leber und Milz ansammelt, um die negativen Auswirkungen der verlängerten Olivenöl Verabreichung wie Fettleibigkeit, übermäßige Steatose, Leber Lipid-Degeneration und Insulinresistenz [45] zu vermeiden, behandeln wir die Ratten täglich nur während 7 Tage und wöchentlich während der ersten zwei Monate, dann starben alle zwei Wochen, bis eine Kontrollratte.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass, während Olivenöl Behandlung eine Steigerung von 18% der Lebensdauer der behandelten Ratten, C60-Olivenöl es erhöhen kann bis zu 90% führen kann, im Vergleich zu Kontrollen. Die Wirkungen von Olivenöl auf der Gesundheit und Alterung sind bekannt [46], und ihre Wirkung als eine Funktion der Dosis gründlich diskutiert [45] ist. Aber, was bemerkenswert ist, ist, dass alle C60-behandelten Ratten bei M38 noch am Leben waren. Somit basiert auf früheren Untersuchungen [44], 60 C sollte zum Verlängern Lebensdauer der effizienteste immer Material sein.

Deutlich schwächer haben ähnliche Effekte bereits in mehreren experimentellen Modellen aber für verschiedene hydrolösliche C60-Derivate [44, 47] berichtet worden. Die Wirkungen von C60-Derivaten auf Alterung wurden auf die antioxidativen Eigenschaften und die Dämpfung von altersbedingten Anstieg des oxidativen Stress zurückzuführen [4, 44].

Tatsächlich bleibt die Radikalfängerwirkung gültig für eine Anzahl von C60-Derivaten mit unterschiedlichen Summanden [3, 4, 44, 47-49], was darauf hindeutet, dass diese Eigenschaft auf die C60-Einheit in Beziehung steht. Tatsächlich C60 selbst ist ein starkes Antioxidans, wie es in verschiedenen Versuchsmodellen gezeigt [5, 6, 21].

Wie unsere Ergebnisse zeigen, dass C60 effizienter als seine Derivate ist [44, 47], bestätigen sie, dass die Auswirkungen von C60-Derivaten auf Alterung vor allem aufgrund der C60-Einheit sind, wie es zuvor postuliert worden ist [4].

Dies ist die erste Untersuchung der in vivo chronischen Wirkungen einer löslichen Form von C60. Die absorbierten Dosen sind sehr gering und ihre Wirksamkeit auf den oxidativen Stress in Frage gestellt werden kann. Wir haben bereits gezeigt , dass C60 ein starkes Antioxidans in einem klassischen ist in vivo Versuchsmodell bei Ratten [21]. Aber wir dann eine wässrige Suspension und die effizientesten Dosen waren etwa 2500-mal höher verwendet (2 g / kg KG), die als für seine Derivate beobachtet diejenigen deutlich höher sind als auch solche für die meisten biomedizinischen Anwendungen eingesetzt. Zusätzlich gab es eine Latenzperiode (14 Tage nach der Verabreichung), um die maximale Effizienz zu erreichen. Es wurde festgestellt, dass es keine Korrelation zwischen dem Grad an Schutz wurde, und die Anzahl von C60-Clustern in der Leber beobachtet, was darauf hindeutet, dass C60 nur in einer löslichen Form, die aktiv ist, wenn seine Doppelbindungen ist zugänglich sind [21].

Um diese Hypothese zu überprüfen, untersuchten wir die Wirkung von C60-Olivenöl-Lösungen in dem gleichen Versuchsmodell.

4.4. Auswirkungen von C60-Olivenöl-Lösungen auf oxidativen Stress

Wie wir bereits geschrieben, vier mögliche Mechanismen für die C60-Leberschutz wurden vorgeschlagen [21]: (1) C60 ein große Anzahl freier Radikale abfangen kann [5, 6, 21]; (2) es kann so wirken, als Zersetzungskatalysator für O2 * / H2O2, wie es für sein tris-Malonsäurederivate postuliert worden [4] oder (3) als ein Cytochrom-P450-Inhibitor, wie es für einige Fullerenderivate wurde berichtet [ 21]; und (4) es kann in aktivieren Kupffer-Zellen (Leber Makrophagen) durch Akkumulation und Überlastung mit einer großen Anzahl von C60 Aggregaten [2].

Bioverteilungsstudien (Tabelle 2) zeigen, dass C60-Leberkonzentrationen nach sieben aufeinanderfolgenden täglichen og oder ip Verabreichung von 4 mg / kg KGW von C60-Olivenöl-Lösung nahezu 7 mal niedriger oder 1,5 mal höher, jeweils als die in früheren Studien beobachtet nach 14 Tagen, nach dem ip-Injektion von hohen Dosen (2 g / kg Körpergewicht) von C60, wenn die optimalen hepatoprotektive Wirkung erhalten wurde [21]. Somit wird, um die Auswirkungen von C60-Öl-Lösungen auf CCl4 Toxizität zu untersuchen, können wir die Tiere täglich für 7 Tage nach ip oder og Verwaltungen vor CCl4 Behandlung vorbehandelt.

Pathologische Untersuchungen zeigen, dass auch bei sehr niedrigen Dosen, 500-fache niedriger als zuvor verwendet [21], C60-Olivenöl-Lösungen schützt effektiv die Leber gegen CCl4 Toxizität. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit dem für sehr niedrigen Dosen von Wasser-Lösung von hydriertem C60-Fulleren in anderen experimentellen Modellen berichten [5, 6].

Die Anzahl der Nekrosen in der Leberschnitte von GEIP Tieren beobachteten, war signifikant niedriger als die in der GEOG Gruppe beobachtet (Fig. 4). Als C60-Konzentrationen in der Leber von GEIP Tiere wahrscheinlich etwa 10-mal höher als die der Leber von Geog Gruppe (Tabelle 2) sind, bestätigen diese Ergebnisse die Dosis-Wirkungs-Beziehung zuvor berichtet [21].

Die Ergebnisse für Leberschädigung Biomarkern erhalten (Fig. 5) sind sogar besser als jene nach der Verabreichung einer großen Dosis erhalten (2 g / kg Körpergewicht) von C60 in wässrigem Medium suspendiert [21]. Diese Ergebnisse bestätigen die Hypothese, wonach dieses Fulleren aktiv gegen oxidativen Stress ist nur in löslicher Form [21]. Darüber hinaus, während der Median von ALT in den GDog Tieren oral behandelt mit C60-Öl zu der der Kontrollgruppe äquivalent war, wurde die Aktivität dieses Enzyms selbst in den GDip Tieren zu senken. Diese Ergebnisse stärken die Dosis-Wirkungs-Beziehung und bestätigt, dass C60 ist ein leistungsfähiges Leberschutzmittel.

In Bezug auf den beteiligten Mechanismus, da die Dosen in diesen Experimenten verwendet werden, sind sehr gering, und da es keine übermäßigen C60 Ablagerungen innerhalb Kupffer-Zellen (hepatische Makrophagen), die Hypothese, wonach C60 diese Phagozyten durch Überlade inaktivieren kann sie [21] müssen verworfen werden.

Die anfänglichen Leberschäden nach CCI4 Verabreichung wird durch seinen Metabolismus durch Cytochrom P450 2E1 (CYP 2E1) , was zur Bildung des Trichlormethyl radikalen CCl3 * [28,29] vermittelt. Dieser Rest kann auch mit Sauerstoff reagieren , eine hochreaktive Spezies zu bilden, die Trichlormethylgruppe Peroxyradikal CCl3OO * , welche die Kettenreaktion der Lipidperoxidation schnell auslösen können [28, 29]. Als C60 ist in der Lage zum Einfangen in vitro eine große Anzahl von Resten pro Molekül [50] einschließlich CCl 3 * und CCl3OO * [51] und da diese Eigenschaft in dem Mechanismus des Schutzes gegen CCl4 Toxizität beteiligt sein, wir die Auswirkungen der C60 auf den antioxidativen Systemen erforscht, die eine wichtige Rolle spielen bei der Abwehr von oxidativem Stress, einschließlich dem zirkulierenden Spiegel von reduzierten (GSH) und oxidierten Formen (GSSG) Glutathion sowie Katalase (CAT) und superoxide- Dismutase (SOD) Aktivitäten in Erythrozyten und Lebern [29].

Die Ergebnisse für das Glutathion-System erhalten (Fig. 5) bestätigen die antioxidative Wirkung von C60 und sogar seine modulierenden Wirkung auf dem intrazellulären Redoxzustand auch in Abwesenheit von CCl & sub4; [21]. Die Ergebnisse für die Antioxidans-Enzymaktivitäten erhalten (Fig. 6) ebenfalls die antioxidative Wirkung von C60 gegen CCl4 Toxizität bestätigen.

Die Unterdrückung der CYP2E1 – Aktivität kann in der Höhe der erhaltenen CCl4 reaktiven Metaboliten in einer Reduktion führen, und eine Abnahme von Gewebeverletzungen entsprechend. Daher wird ein möglicher Mechanismus für die Leber-Schutz durch C60 kann CYP2E1 Hemmung beinhalten. Wie C60 unlöslich in den üblichen biologischen verwendeten Systemen = die Studie in vitro – Aktivität dieses Enzyms, wir die hepatische mikrosomale Fraktionen von oral behandelten Ratten verwendet , um die CYP2E1-spezifische oxidative Aktivität p-nitrophenol hydroxylase [33] , um zu überprüfen , um assay diese Hypothese. C60-Vorbehandlung deutlich abgeschwächt die
Erhöhung der CYP2E1-Aktivität nach CCl4 Intoxikation ohne inhibitorische Wirkung auf dieses Enzym (Fig. 7). Die Abwesenheit von inhibitorischen Wirkungen wird in Gegenwart einer Restaktivität spiegelt deutlich höher als die der Kontrollgruppe. Außerdem ist die Aktivität der Kontrollgruppe mit C60 behandelt nur nicht signifikant verschieden von der Kontrollgruppe nur mit Wasser behandelt. Deshalb ist die Hypothese von CYP2EI Hemmung durch C60 muss auch entsorgt werden.

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie, insbesondere die Verhinderung von GSH Erschöpfung, deuten darauf hin, vielmehr, dass die Schutzwirkung einen Radikalfänger Mechanismus beinhaltet.

Es wurde mehr Genotoxizität erzeugte kürzlich berichtet, dass die Verabreichung von C60 suspendierte (nicht gelöst) in Maisöl von Schlundsonde kann die hepatische Ebene von 8-Oxo-dG erhöhen, während Maisöl per se als die Partikel [52]. Überraschenderweise haben die Autoren nicht zu dem Schluss, dass C60 die Genotoxizität des gebrauchten Fahrzeugs verhindern.

Es ist hervorzuheben, dass gelöste C60 als hundert mal aktiver erscheint, wenn sie in Suspension ist [21]. In der Tat ist die Wirkung von löslichem C60 sofort, während die von suspendierten C60 verzögert wird, weil es zu wirken, gelöst werden muss. In allen Fällen basierend auf C60-Gehalt der Leber (Tabelle 2), beweisen diese Ergebnisse, dass diese Fulleren im Nano molar Ebene aktiv sind. Allerdings werden die beteiligten Mechanismus bleibt etabliert.

Für die Zeit , um die Hypothese des Radikalfänger von CCl3O * oder CCl3COO wobei * möglich bleibt. C60 könnte als Radikalfänger wirkt , wie es weithin demonstriert wurde in vitro , aber bisher keine resultierenden C60 – Addukt bis beobachtet in vivo . Die einzige in vivo – Reaktion je für C60 beobachtet einen Dielse-Alder – Reaktion mit wie Retinol und Retinyl-Ester in den Leberzellen [42]. Wir versuchen derzeit von einer möglichen Radikaladdition einig C60-Addukte zu erkennen führt.

C60 könnte auch als eine Superoxid-Dismutase – Mimetikum handeln , wie sie modelliert wurde in silico und experimentierten in vitro für einen ihrer wasserlöslichen Derivate [4]. Allerdings zeigen unsere Ergebnisse , dass dies für unberührte C60 unwahrscheinlich ist , weil der Anstieg der H2O2 – Konzentration aufgrund einer solchen Aktivität eine korrelierte Zunahme von Katalase induzieren sollte
Aktivität, was nicht der Fall unter unseren Bedingungen (Fig. 6) ist. Alternativ könnte C60 wirken als Superoxid / Katalase – Mimetika in vitro [4], aber dies ist nicht der Fall in vivo .

Ein anderer möglicher Mechanismus wurde auch für Wasser-Lösungen von hydriertem Fulleren C60 vorgeschlagen [6]. Sie schlägt vor, dass die strukturierte Wasserschicht um C60 der Lage sein kann, indem man die Rekombination zu Wasserstoffperoxid Hydroxylradikale zu deaktivieren. Wieder einmal bleibt dieser Mechanismus durch andere Experimente bestätigt werden.

5. Schlussfolgerung

Die Wirkung des ursprünglichen C60 auf Lebensdauer betont das Fehlen der chronischen Toxizität. Diese Ergebnisse, die mit einer kleinen Stichprobe von Tieren, die mit einem explorativen Protokoll bitten um eine umfangreichere Studien, die die intestinale Resorption von C60 sowie die verschiedenen Parametern des Verwaltungsprotokolls zu optimieren: Dosis, Dosierung und Behandlungsdauer. Im vorliegenden Fall wurde die Behandlung gestoppt, wenn eine Kontrollratte bei M17 gestorben, was beweist, dass die Auswirkungen der C60 Behandlung sind langlebig als die geschätzte mittlere Lebensdauer für C60-behandelten Ratten 42 Monate sind. Man dachte, dass eine längere Behandlung noch längere Lebensdauer erzeugt haben könnte. Wie der auch sei, sollte diese Arbeit öffnet den Weg zur Entwicklung des beachtlichen Potenzials von C60 im biomedizinischen Bereich, einschließlich der Krebstherapie, neurodegenerativen Erkrankungen und Alterung. Außerdem,

Anerkennungen

Diese Arbeit wurde von dem CMCU Zuschuss teilweise unterstützt (Ref. No: ST / AM / GM / 4C5 001 / nº1233 Cote:. 6.2.2).

Wir danken Prof. Stephen R Wilson für seine wertvollen Kommentare.

Artikel-Link:
https://www.researchgate.net/publication/224004891_The_prolongation_of_the_lifespan_of_rats_by_repeated_oral_
administration_of_60fullerene

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